O uso de um modelo celular (ou animal) validado da doença alvo foi utilizado com sucesso como uma segunda triagem para a seleção de substâncias com maior afinidade/potência.
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Nota-se que alguns autores consideram que uma substância ativa só poderia ser chamada de protótipo se ela tiver efeito em um modelo animal da doença alvo. Um modelo animal ideal deveria possuir validade fenotípica (semelhança de aspectos entre o modelo e a doença), validade de construção (mesmo mecanismo ou estado interno subjacente à doença) e validade preditiva (capacidade de identificar tratamentos terapêuticos para a doença humana).
Você conseguiu estabelecer uma boa relação estrutura-atividade, garantindo uma otimização futura de suas substâncias.
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A relação estrutura-atividade (REA) é a relação entre a estrutura química e a atividade biológica de uma série de substâncias. Uma análise de REA permite a determinação do grupo químico responsável por um determinado efeito biológico no organismo. Uma abordagem matemática da REA (QSAR, acrônimo inglês para Quantitative Structure-Activity Relationship) faz uso de modelos que relacionam a estrutura química e a atividade farmacológica de um modo quantitativo para uma série de substâncias
Resultados de ensaios in vitro de solubilidade, coeficiente de partição e propriedades fisicoquímicas in silico anteriores permitem filtrar as substâncias ativas (hits) de acordo com a regra dos cinco de Lipinski.
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Apesar dos métodos in silico fornecerem valiosas informações de forma rápida e economicamente mais acessível, a solubilidade em água e o coeficiente de partição octanol-água devem ser avaliados experimentalmente (in vitro). É considerada muito boa uma solubilidade em água > 100 µM. O coeficiente de partição octanol-água visa avaliar a permeabilidade através da membrana celular fosfolipídica e é expresso em logaritmo da razão entre as concentrações da substância na fase octanólica e aquosa (LogP). Frequentemente, se utiliza o coeficiente de distribuição (LogD), quando a fase aquosa é tamponada para um determinado pH, visando avaliar o coeficiente de partição efetivo em diferentes pHs do trato gastrintestinal.
Os resultados de uma avaliação de seletividade de suas substâncias em um painel de 44 “não-alvos” indicam que seus principais candidatos a protótipos têm uma boa seletividade.
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Tipicamente, uma primeira avaliação de segurança se faz precocemente como ferramenta para auxiliar na seleção de protótipos. Um painel comum a várias grandes empresas farmacêuticas reúne 44 proteínas, entre receptores, enzimas e canais, cuja ativação ou bloqueio poderia ser fonte de efeito adverso. A avaliação da segurança baseia-se na seletividade que a substância tem para o alvo em relação às proteínas “não-alvos” (off-target). Podemos considerar que uma seletividade da ordem de 100 é segura, a qual é medida pela razão entre os valores de Ki para “não-alvo” e “alvo”.
https://www.sbfte.org.br/wp-content/uploads/2018/04/10.-Especificidade-Seletividade.pdf
Os resultados do teste de AMES indicam que seus principais candidatos a protótipos não são genotóxicos in vitro.
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A genotoxicidade descreve a propriedade de substâncias químicas que danificam a informação genética dentro de uma célula, levando ou não a mutações. O teste de AMES é um dos mais simples e o primeiro teste de genotoxicidade a ser feito.
Os resultados com biomarcadores indicam excelente eficácia do(s) seu(s) protótipo(s) eleito(s), em um modelo animal validado da doença alvo.
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Durante o processo de descoberta, é essencial ter prova de eficácia em algum modelo animal da doença alvo. Um modelo animal ideal deveria possuir validade fenotípica (semelhança de aspectos entre o modelo e a doença), validade de construção (mesmo mecanismo ou estado interno subjacente à doença) e validade preditiva (capacidade de identificar tratamentos terapêuticos para a doença humana). A ausência de modelo animal com boa preditividade é uma das causas da falta de translacionalidade de dados para a clínica, sendo responsável por falhas que ocorrem durante os ensaios clínicos, quando não se repete a eficácia observada em modelos celulares ou animais.
Os estudos ADME in vitro indicam que o(s) seu(s) protótipo(s) eleito(s) possui(em) boa estabilidade em hepatócitos humanos, boa permeabilidade celular (células CACO-2 ou MDCK), bom perfil metabólico com identificação do principal CYP envolvido e sem problemas relevantes quanto à inibição de CYPs relevantes.
ISBEFS: 4$
Após ter feito uma primeira estimativa de alguns parâmetros farmacocinéticos in silico, com softwares específicos, tais propriedades são avaliadas em células ainda na fase de seleção de protótipos porque tais métodos in vitro são mais rápidos e menos custosos do que os ensaios in vivo, em animais de experimentação.
Estudos ADME in vivo foram realizados em ratos e cães e os dados da administração i.v. e oral são consideradas bons.
ISBEFS: 4$
Por força da legislação internacional, estudos farmacocinéticos avaliando estas propriedades devem ser efetuados em duas espécies animais, sendo que uma não pode ser roedor. Estes estudos são geralmente feitos em ratos e cães, quando se estabeleça o perfil da evolução temporal da concentração plasmática após administração por via oral e intravenosa.
Seus protótipos estão livres de citotoxicidade quando testados em hepatócitos humanos e numa célula relevante para a doença alvo.
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O teste de citotoxicidade in vitro é fundamental para selecionar/filtrar as substâncias dentro do processo de descoberta de fármacos. Atualmente, há três tipos principais de ensaios de citotoxicidade adaptáveis para triagem de alto rendimento (HTS). Esses métodos medem a viabilidade celular através de ensaios bioluminescentes de ATP ou a citotoxicidade através de enzimas liberadas no meio de cultura, como a enzima lactato desidrogenase (LDH, acrônimo do inglês Lactate DeHydrogenase).
Idealmente, a substância em teste não deveria ter efeito citotóxico em concentração 50 vezes maior do que o CE50 para efeito alvo, tanto em
células hepáticas (Hep G2) como numa célula relevante para a doença alvo. Hep G2 (ou HepG2) é uma linhagem celular imortal derivada do
tecido hepático de um adolescente com um carcinoma hepático.
Você concluiu o primeiro teste de toxicidade com sucesso, usando um protocolo de escalonamento de dose que leva à determinação da dose máxima tolerada (MTD: Maximum Tolerated Dose) em rato e em um animal não roedor.
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Historicamente, as informações de toxicidade aguda, como o MTD, eram obtidas a partir de estudos de toxicidade de administração única (3 doses, em animais diferentes) em duas espécies de mamíferos, utilizando a via de administração a ser usada na clínica e a via parenteral, havendo observação dos animais durante 14 dias após o tratamento. Contudo, essas informações podem ser obtidas a partir de estudos mais flexíveis de escalonamento de dose ou de estudos DRF de curta duração (DRF: Dose Range Finding).
As doses limites para estudos de toxicidade aguda, subcrônica e crônica de 1000 mg/kg/dia para roedores e não roedores são consideradas apropriadas.
Referência: M3(R2) Nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals (FDA, ICH, 2010).